واحد ارومیه دانشکده علوم پایه-گروه زیست شناسی پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد (M.Sc) رشته: ...

۱-۷-۱۹ دیگر محصولات شاه میگوی آب شیرین ۳۷
۱-۷-۲۰ دستورالعمل های  HACCPو فرآوری شاه میگو. ۴۰
۱-۸ عوامل موثر در نگه داری مواد غذایی ۴۱
۱-۸-۱ نگهداری مواد غذایی در دمای پایین ۴۱
۱-۸-۲ میکروارگانیسم های سایکروفیل. ۴۱
۱-۸-۳ اوری سایکروتروف. ۴۲
۱-۸-۴ استنو سایکروتروف. ۴۲
۱-۸-۵ دسته بندی دمای پایین جهت نگهداری مواد غذایی ۴۲
۱-۸-۵-۱ دمای سرد کردن ۴۲
۱-۸-۵-۲ دمای یخچال ۴۳
۱-۸-۵-۳ دماهای فریزر. ۴۳
۱-۸-۶ حداقل دمای رشد باکتری ها ۴۳
۱-۸-۷ مدل سازی و ویژگی های کیفی تعیین زمان ماندگاری در فرآورده های نگهداری شده در انبار۴۴
۱-۸-۸ تاثیر درجه حرارت بر روی نرخ میزان فساد. ۴۴
۱-۹  شاخص های کیفیت و فساد .۴۴
۱-۹-۱ مدل سازی جنبشی برای میکروب ها براساس رشد آنها.۴۵
فصل دوم. ۴۶
پیشینه پژوهش ۴۶
۲-۱ مقدمه ۴۷
۲-۲ جمعیت میکروبی. ۴۷
۲-۳ جمع بندی.۵۳
فصل سوم ۵۴
روش شناسی ۵۴
۳-۱مقدمه ۵۵
۳-۲ جامعه آماری و نمونه برداری ۵۵
۳-۳ ابزار های گردآوری داده ها ۵۶
۳-۳-۱ مواد مورد نیاز. ۵۶
۳-۳-۲ محیط های کشت و لوازم و دستگاه های مورد نیاز. ۵۶
۳-۴ شیوه تجزیه و تحلیل داده ها. ۵۹
۳-۵ آزمون های شیمیایی ۵۹
۳-۵-۱ اندازه گیری pH.
3-5-2  اندازه گیری مجموع بازهای نیتروژنی فرار ( TVB-N )60
3-5-3  اندازه گیری اندیس تیوباربیوتوریک اسید( TBARS ) 60
3-5-4  اندازگیری اندیس پراکسید(PV). 61
3-5-5-  TBA
3-6 آزمون های میکروبی ۶۱
فصل چهارم ۶۲
تجزیه و تحلیل داده ها. ۶۲
۴-۱ مقدمه. ۶۳
۴-۲ توصیف متغییر ها ۶۴
۴-۲-۱ متغییر های میکروبی ۶۴
۴-۲-۱-۱ فساد میکروبیMicrobial Spoilage
4-2-1-2 شمارش کلی میکروبی(total count) به روش) pour plate (TVC
4-2-1-3 باکتری های سرمادوستPTC
4-2-2 آزمون های شیمیایی. ۶۵
۴-۲-۲-۱ فسادشیمیایی Chemical Spoilage.
4-2-2-2 اندازه گیری اسیدیته ۶۵
۴-۲-۲-۳ اندیس PV.
4-2-2-4-TBA
4-2-2-5-TVB-N.
4-3 آزمون فرضیه ها و سوالات ۶۶
۴-۴ آزمون های میکروبی ۶۶

۴-۵ آزمون های شیمیایی ۶۹

فصل پنجم. ۷۳
بحث و نتیجه گیری.۷۳
۵-۱ یافته ها .۷۴
۵-۱-۱ آزمون های شیمیایی ۷۴
۵-۱-۲ آزمون های میکروبی ۷۶
۵-۲ نتیجه گیری کلی ۷۷
۵-۳ پیشنهادات ۷۷
منابع. ۷۸
چکیده:
در این پژوهش تغییرات کیفیت شیمیایی و میکروبی  فیله ی دمی شاه میگوی درازآب شیرین درطول نگهداری درشرایط انجماد بررسی شد .نمونه ها پس ازصید،آماده سازی،پوست کنی در شرایط مجاورت هوا بسته بندی ودردمای ۱۸- درجه سانتی گراد درفریزر نگهداری شدند. آزمونهای کیفی ومیکروبی درزمان های صفروهرماه یکبار بمدت ۶ ماه با یک تیمار وسه تکراربرای هر دوره آزمون بر روی فیله های منجمد انجام شد.نتایج نشان دادندکه درپایان شش ماه نگهداری درسردخانه میزان (میانگین± خطای استاندارد) تیوباربیوتوریک اسید( (TBARS  از  ۰۷/۰ ±۱۹/۰به  ۲۵/۰ ±۴۵/۱میلی گرم مالون دی آلدئید بر کیلوگرم ؛ میزان پراکسید (PV)از ۲۱/۰±۸۲/۰ به  ۳۰/۰ ±۲/۲ میلی اکی والان اکسیژن در کیلوگرم چربی ماهی ؛  مجموع بازهای نیتروژنی فرار ( (TVB-Nاز ۰۱/۱±۲۱/۱۳به ۴۰/۱±۶/۲۶ میلی گرم در ۱۰۰ گرم گوشت رسیدکه علیرغم اختلاف معنی دار با یکدیگر (۰۵/۰>P) در محدوده قابل قبول برای مصرف بودند.میزان pH تا پایان ماه پنجم (۰۰/۰±۲/۶) تغییرات معنی داری نداشت(۰۵/۰<P) ولی این میزان از ماه ششم(۰۵/۰ ±۵۵/۶ )بطور معنی داری افزایش یافت (۰۵/۰>P).مقدارکل باکتری ها (TVC) در ابتدای دوره از۰۰/۰ ±۴۸/۳  به ۰۹/۰ ±۸۷/۶ logCFU/g وباکتریهای سرمادوست(PTC) از۰۰/۰ ±۱ به  ۲۵/۰ ± ۷۵/۶ logCFU/gرسید .مقایسه درون گروهی پارامترهای مذکورطی دوره آزمون با یکدیگراختلاف معنی داری را نشان دادند(۰۵/۰>P) ولی ازماه ششم مقدار باکتری های سرما دوست در آستانه مصرف قرار گرفت.

فصل اول: کلیات

مطلب دیگر :

دانلود پایان نامه رشته روانشناسی با موضوع: تمایل به ترک خدمت - خلاقیت و نوآوری تحول آفرین

۱-۱- مقدمه
شاه میگوها در۱۲۰۰جنس و ۱۰۰۰۰گونه مختلف طبقه بندی میشوند .از آن میان حدود ۵۰۰ گونه شاه میگو درجهان وجود دارد که در ۲۳ جنس جای می گیرد(Lodge, Taylor, Holdich, & Skurdal,2000). ( در دهه اخیرشاه میگو بعنوان یکی از غذاهای آبزیان ویژه درآمریکا محسوب می شود(Martin, Carter, Flick Jr, & Davis,2000 ).
سالیانه ۱۱۰ هزارتن انواع شاه میگوی آب شیرین ) تقریبا ۱۲ گونه (در دنیا صیدتجاری می شودکه دراین میان آمریکا ۵۵ درصد ،چین ۳۶ درصد واروپا واسترالیا هم بخشی از باقی مانده را بصورت فرآوری شده دراختیار مصرف کنندگان قرارمی دهند(Martin et al., 2000). شاه میگوی دراز آب شیرین A.leptodactylus)) بعلت دارا بودن مقادیر بالایی از اسیدهای چرب امگا ۳ مانند ایکوزاپنتاانوئیک اسید و دوکوزاهگزاانوئیک اسید بعنوان یکی از گونه های تجاری به طور گسترده ای در بسیاری از کشورها مصرف دارد. این موجود درکشورهای متعددی به عنوان مثال لهستان، ایتالیا، آلمان، انگلستان، اسپانیا و فرانسه بطور ناخواسته) فرار از مراکز فروش( به منابع آبی راه پیداکرده وجمعیت های مشخصی را برای خود ایجادکرده اند(Harlioğlu,2004). امروزه این موجوددر ۲۷ کشورجهان یافت می شود که در ۱۴ کشور بصورت معرفی به منابع آبی حضورآنها میسربوده است(Skurdal, Taugbol, & Holdich, 2002).
شاه میگوی دراز آب شیرین( A. leptodactylus )تنها گونه از جنس Astacus در ایران می باشدکه از منابع آبهای شیرین داخلی صید می گردد.در بین منابع آبی ،دریاچه مخزنی پشت سد ارس واقع در شهرستان پلدشت از توابع استان آذربایجان غربی زیستگاه اصلی وتنهامحل صیدتجاری این موجود در ایران است که سالیانه بیش از ۲۰۰ تن آن به کشورهای اروپایی صادر می شود((Nekuie Fard et al., 2011.
ارزش بالای تجاری شاه میگو های دراز آب شیرین در اروپا، باعث شده که به عنوان یک تولید مهم اقتصادی مطرح باشد مهمترین کشورهای تولید کننده A.leptodactylus. روسیه ، ترکیه، فرانسه و اسپانیا هستندکه تقریباً توانایی تامین همه نیازهای کشورهای اروپای غربی و اسکاندیناوی را دارند(Nekuie Fard et al.,) 2011(.
مصرف کنندکان اروپایی ترجیح می دهند A.astacus را که یک گونه اروپایی با ارزش تر نسبت بهA.leptodactylus است را مصرف کنند. ولیکن A.leptodactylusهمیشه جایگاه خاص و مهمی را دربین مصرف کنندگان شاه میگو آب شیرین در اروپا دارا است(Harlioğlu,2004 ) .آمارها نشان می دهد که سود تجاری A.leptodactylus با کاهش جمعیت A.astacusبه علت بیماریها و آبهای آلوده به طور محسوس افزایش یافته است(Harlioğlu,2004 ).بنابراین مصرف کنندگان اروپایی به منظور تامین گوشت مصارف داخلی خود شروع به واردات A.leptodactylus نموده اند(SamCookiyaei et al.,2012 ).
افزایش تقاضا برای این محصول ، توزیع کنندگان رابرای بهینه سازی و ارائه محصولات متنوع فرآوری برطبق ذائقه مشتریان خود به چالش کشیده است.بطوریکه علاوه برتولید محصول می بایستی سلامت آن رانیز برای مصرف کننده تضمین نمایند. ازآنجائیکه فساد در آبزیان وابسته به درجه حرارت و زمان بوده وپراکنش زیادی بین کشورهای تولید و فرآوری کننده ودرخواست کننده وجود دارد استفاده ازسیستم انجماد، بسته بندی شاه میگو در شرایط خلاء بعنوان فن آوری های کمک کننده جهت افزایش عمرماندگاری و جلوگیری از فسادشیمیایی،اکسیداسیون و میکروبی محسوب می شود ((Gates, 2012.
از آنجائیکه تاکنون تحقیقی برای تعیین عمر ماندگاری گوشت خام دمی A.leptodactylus در دمای انجماد     -۱۸ درجه سانتی  گراد در شرایط بسته بندی با خلاء صورت نگرفته بود، این تحقیق انجام شد تابا تکیه به یافته های آن توزیع کنندگان و کارخانجات فرآوری درجهت بهینه سازی روش های فرآوری خود برحسب ویژگی های گونه ای بهره برداری لازم را بعمل آورند.
۲-۱- بیان مسئله
در چند سال اخیر  شیلات ایران فعالیتهای چشمگیری در زمینه گسترش آبزی پروری و به ویژه صید و بهره برداری از ذخایر شاه میگوی دراز آب شیرین موجود در سد ارس و صادرات آن به خارج از کشور انجام داده است.بطوریکه بیش از ۲۰۰ تن شاه میگو دراز آب شیرین   توسط۸ شرکت صیادی،صیدوبه خارج ازکشورصادرمی شودکه موجب ارز آوری متنابهی برای کشورمی شود. بنابراین بنظر می رسد این روند افزایشی صادرات، ادامه خواهد داشت.هدف از طراحی و ترویج سیستم عرضه شاه میگو  حفظ کیفیت گوشت این آبزی صادراتی ، ایجاد اشتغال در بخش خصوصی و بکارگیری نیروهای متخصص ، ارز آوری  و. می باشد.
با تمام این اوصاف،دستورالعمل مکتوبی در زمینه شرایط ونحوه نگهداری فیله شاه میگوی دراز آب شیرین   نه تنها در کشور بلکه در سایر کشورهای جهان وجود ندارد. لذا انجام اینگونه طرح ها میتواند نقش مهمی در پیشرفت روش های نوین مدیریت نگهداری و عرضه شاه میگو دراز آب شیرین و ارتقا سطح سلامت مصرف کنندگان و توسعه صادرات کیفی و به طبع آن افزایش ارزآوری و  سود اقتصادی بهره برداران و  عرضه کنندگان شاه میگو دراز آب شیرین  ایفا نماید. در حال حاضر بدلیل تحریمهای اعمال شده علیه کشورمان و عدم توانایی صادرکنندگان در انتقال ارز از خارج کشور به داخل و هرگونه مبادلات تجاری بخصوص با کشورهای اتحادیه اروپا امکان قطع صادرات شاه میگو وجود دارد . بنابراین باید روش های فرآوری و کنترل فساد میکروبی نیز نگهداری طولانی مدت این آبزی باارزش مورد بررسی قرار گیرد. بنابراین در مراحل اجرای این طرح روش استحصال گوشت از ناحیه دم و انجماد آن و نگهداری در شرایط انجماد و بررسی عمر ماندگاری آن پیش بینی گردیده است.
۳-۱- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
امروزه شاه میگوی دراز از دریاچه پشت این سد بطور سنتی وبا بهره گرفتن از تله های حلقوی و تاشو صید شده و بدون انجام آزمایشات لازم و تامین استاندارد های مورد نیازنسبت به صادرات آن به خارج از کشور اقدام می شود . باتوجه به نبود اطلاعات درخصوص اثرات جابجایی و دستکاری بر کیفیت فیزیکی و شیمیایی و بار میکروبی شاه میگوی دراز آب شیرین

دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی گروه زیست شناسی دریا پایان نامه دکتری رشته زیست شناسی دریا گرایش جانوران ...

جمعیت ها در مقیاس بزرگ استفاده شود. با این وجود یک محدودیت عمده در کاربرد خصوصیات ریخت شناسی در سطوح داخلی وجود دارد که در آنها اختلافات فنوتیپی تحت کنترل مستقیم ژنتیکی قرار ندارد بلکه تعییرات محیطی نیز دخالت دارند (Bhassu et al., 2008).
امروزه با پیشرفت های  فن آوری بطور فزآینده ای از ژنتیک در تعیین تفاوت های جمعیت گونه های ماهی استفاده می شود. با فن آوری های مولکولی می توان تفاوت بین نژاد ها، ژنوتیپ ها یا افراد را در تحقیقات ژنتیک جمعیت با دقت مورد بررسی قرار داد. توصیف ویژگی های مختلف در سطوح  جمعیت می تواند به درک تنوع و ساختار ژنتیکی  بین و مابین جمعیت و نیز  مطالعه و حفاظت از جمعیت های کوچک بکار رود (Diniz et al., 2007). یکی از مسائل اساسی و بسیار مهم،  خصوصیات ژنتیکی ماهیان می باشد که با بررسی دقیق آن می توان اطلاعاتی جامع برای حفاظت از ماهیان و ارزیابی ذخایر یک جمعیت کسب کرد.
منابع ژنتیکی در حقیقت ماده خام و دست مایه ی اصلی پژوهشگران برای تولید       فرآورده های زیستی می باشد که بدون آن فن آوری زیستی دستاوردی نخواهد داشت. بنابراین به موازات گسترش فنون زیست فن آوری[۱]، حفاظت ذخایر ژنتیکی را باید به عنوان سرمایه و ثروتی که روز به روز ارزش بیشتری پیدا  می کند، در راس اولویت های تحقیقات قرار داده و با یک برنامه ملی و همه جانبه امکان حفاظت و بهره برداری هر چه بهتر از ژن های موجود در تنوع زیستی کشور را در برنامه های فن آوری زیستی موجود فراهم نمود. شناسایی، حفاظت و استفاده پایدار از تنوع ژنتیکی فوق العاده ای که در منابع ژنتیکی آبزیان ایران مشاهده می شود برای موفقیت هر برنامه به نژادی و یا زیست فن آوری امری ضروری است (رجایی و رجایی، ۱۳۸۳).
کشورمان علاوه بر۴۴۰ هزار منبع آبی داخلی با ۱۸۰۰ کیلومتر مرز آبی در خلیج فارس و دریای عمان و حدود ۹۹۰ کیلومتر از سواحل جنوبی دریای خزر تنوع عظیمی از موجودات آبزی را در خود جای داده است. بنابراین دارای منابع غنی از آبزیان و توانایی بالا در پرورش و صید ماهی می‌باشد (Coad, 1998).
بنابراین با توجه به اهمیت تنوع ژنتیکی ونقش آن در بررسی تاریخچه ی جمعیت‌ها و گونه‌ها، و ضرورت شناخت و حفاظت تنوع در حداقل کردن احتمال از بین رفتن گونه‌های مطلوب و پایدار کردن گونه‌ها (تنوع ژنتیکی برای سازش تکاملی گونه‌ها با تغییرات محیطی لازم است)، همچنین با توجه به اهمیت بالای ماهیان ممتاز به ویژه راشگوی معمولی در اقتصاد شیلاتی کشور به ویژه استان های جنوبی، سعی شد با بررسی بنیان ژنتیکی این ماهی، راه را برای مدیریت حفاظت این گونه‌ هموار نمود و راهکار‌هایی برای حداقل نمودن زوال تنوع ژنتیکی پیدا کرد.

در خصوص اهمیت شیلاتی راشگوی معمولی بایستی به نکات زیر اشاره نمود که این ماهی از دیر باز مورد توجه ویژه ساحل نشینان و در زمره ماهیان ممتاز منطقه خلیج

 فارس و دریای عمان قرار دارد. این گونه بعد از حلوا سفید  Pampus argenteus  بالاترین قیمت در میان آبزیان حوزه خلیج فارس را به خود اختصاص داده است. هرچند 

مطلب دیگر :

پنج ساعت پرواز یک نوجوان روی چرخ هواپیما

ذخایر این آبزی نسبت به ذخایر سایر ماهیان بسیار کمتر می باشد، اما از لحاظ ارزش اقتصادی مهم تر است. اهمیت این ماهی در اقتصاد شیلاتی کشور به حدی است که با وجود اینکه درصد کمی از فرآورده های شیلاتی را تشکیل می دهد، اما میزان درآمد آن قابل توجه می باشد (رجایی و رجایی، ۱۳۸۳).

۱-۱-۱-اهداف و فرضیه های تحقیق
با توجه به اهمیت خصوصیات  ژنتیکی و نقش آن در بررسی تاریخچه ی جمعیت ها و بررسی موارد تکاملی گونه ها، ضرورت شناخت و حفاظت ژنتیکی در به حداقل رساندن احتمال از بین رفتن گونه ها و از طرفی پایدار کردن گونه ها (تنوع ژنتیکی برای سازش تکاملی با تغییرات محیطی لازم است) محرز می باشد (بابایی و همکاران،۱۳۸۰). گسترش برنامه های مدیریتی و انجام       فعالیت های بازسازی ذخایر ماهی راشگوی معمولی هنگامی می تواند مفید باشد که تنوع ژنتیکی ساختار جمعیتی آن درک شود زیرا این اطلاعات در انتخاب جمعیت های دهنده ژن در تکثیر مصنوعی و در امر بازسازی ذخایر ضروری به نظر می رسد.
در زمان شروع این مطالعه بعلت نبود هیچگونه اطلاعاتی در خصوص توالی های     ریزماهواره ای (بانک ژنی[۱] و سایت های مربوطه از جمله [۲]NCBI) ماهی راشگوی معمولی و حتی خانواده این ماهی، تلاش گردید  با تعیین توالی‌های نوکلئوتیدی و شناسایی و جداسازی آغازگرهایی برای تکثیر توالی های ریزماهواره ای[۳] از ژنوم این ماهی، تکنیک مولکولی مفیدی مبتنی بر ریزماهواره، در جهت شناسایی جمعیت راشگوی معمولی در سواحل خلیج فارس با اهداف کلی ذیل ارائه شود:
۱- تعیین توالی ریزماهواره های جداسازی شده
۲- طراحی آغازگرهای ریزماهواره برای این ماهی برای اولین بار و ثبت در مراکز بین المللی برای مطالعات بعدی در این گونه و خانواده
۳- آزمون آغازگرهای شناسایی شده در جمعیت ماهیان مورد مطالعه جهت بررسی چندشکلی

واحد علوم و تحقیقات کرمان دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در ...

۳-۵-۳ جداسازی باکتری های تجزیه کننده ۵۱
۳-۵-۳-۱ جداسازی و غربالگری باکتری های  تجزیه کننده.۵۱
۳-۵-۳-۲ تست های تکمیلی ۵۲
۳-۵-۳-۲-۱ سنجش رشد باکتری. ۵۲
۳-۵-۳-۲-۲ فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24). 52
3-5-3-2-3  سنجش حذف فنل ۵۲
۳-۵-۳-۲-۴ سنجش حذف نفتالین. ۵۲
۳-۵-۴ شناسایی باکتری ها ۵۳
۳-۵-۴-۱ استخراج DNA ژنومی با روش فنل کلروفورم ۵۳
۳-۵-۴-۲ تعیین غلظت DNA استخراج شده. ۵۴
۳-۵-۴-۳ برنامه وغلظت مواد مورد استفاده در PCR.
3-5-4-4 بررسی محصول PCR
3-5-4-5BLAST  کردن نتایج حاصل از توالی یابی نوکلئوتیدی نمونه ها.۵۵
فصل چهارم: نتایج یافته های تحقیق
۴-۱- نمونه برداری. ۵۷
۴-۲- شمارش باکتری ها. ۵۸
۴-۲-۱ شمارش تعداد کل هتروتروف‌ها ۵۸
۴-۲-۲ شمارش تعداد کل تجزیه کننده‌ها. ۶۰
۴-۳- نکات ایمنی جهت استفاده از فنل و نفتالین ۶۱
۴-۴- جداسازی میکروارگانیسم های تجزیه کننده ۶۲
۴-۴-۱ کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه فنل جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده فنل.۶۲
۴-۴-۲ کشت نمونه‌ها در محیط ONR7a به اضافه نفتالین جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه کننده نفتالین.۶۲
۴-۵- تست‌های تکمیلی جهت انتخاب باکتری‌هایی با توان بالای تجزیه فنل و نفتالین.۶۳
۴-۵-۱ سنجش میزان رشد باکتری های تجزیه کننده فنل و نفتالین.۶۳
۴-۵-۲ فعالیت امولسیون کنندگی (E24). 67
4-5-3 سنجش حذف ترکیبات آروماتیک. ۷۱
۴-۵-۳-۱ سنجش حذف نفتالین. ۷۱
۴-۵-۳-۲ سنجش حذف فنل. ۷۳
۴-۶- شناسایی مولکولی نمونه های تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک۷۵
۴-۶-۱ بررسی محصول PCR.
4-6-2 BLAST کردن توالی نوکلئوتیدی نمونه ها ۷۶
۴-۷- رسم درخت فیلوژنی برای سویه‌ها ۹۲
۴-۸- فاصله ژنتیکی بین سویه‌ها. ۹۴
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
۵-۱- بحث و نتیجه گیری. ۹۷
۵-۲- پیشنهادات. ۱۰۰
منابع و مآخذ ۱۰۱
فهرست منابع فارسی. ۱۰۱
فهرست منابع انگلیسی ۱۰۳
چکیده انگلیسی. ۱۰۸
چکیده:

ترکیبات آروماتیک, جز آلاینده‌های نفتی بوده که در ساختمان مولکولی آن‌ها حلقه‌های بنزنی بکار رفته و به لحاظ پایداری در محیط‌های آبی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. از آنجا که این ترکیبات بعنوان آلاینده‌های مهم در فهرست سازمان حفاظت از محیط زیست آمریکا آمده‌اند و از طرفی که سال ۲۰۱۳ بعنوان سال جهانی حفاظت از محیط زیست نامگذاری شده است و در دهه‌های اخیر به دلایل مختلف آلودگی آب خلیج‌فارس بعنوان یک محیط بسته دریایی به این ترکیبات افزایش یافته است. هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک از نوار ساحلی استان بوشهر در خلیج‌فارس است. یکی از روش‌های کاهش آلاینده‌های 

مختلف, روش بیولوژیک و استفاده از میکروارگانیسم ها جهت پاکسازی این‌گونه آلاینده‌ها است. در این مطالعه تعداد ۲۵ نمونه آب, ۶ نمونه خاک و ۴ آب و خاک از نقاط مختلف با پراکنش مشخص از نوار ساحلی استان بوشهر جمع آوری گردید نمونه‌ها به محیط اختصاصی ONR7a منتقل شد, سپس در محیط نوترینت آگار کشت داده شده و بر باکتری‌های جدا شده تست‌های میزان رشد و فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و سنجش حذف برای بررسی میزان تجزیه فنل و نفتالین انجام شد. از باکتری‌های جدا شده جهت تشخیص مولکولی, جداسازی DNA انجام شد, سپس توسط پرایمر‌های Uni_1492R و Bac 27_F مورد PCR قرار گرفت و در نهایت تعداد ۹ باکتری به عنوان تجزیه کننده فنل و نفتالین معرفی شدند. نتایج این تحقیق به وجود آلودگی به فنل و نفتالین در نوار ساحلی استان بوشهر و تفکیک منطقه‌ای هر باکتری انجامید. سپس با توجه به رسم درخت فیلوژنی و بررسی فاصله بین نمونه‌ها از صحت نتایج اطمینان حاصل شد.

فصل اول: کلیات تحقیق
۱-۱- مقدمه

خلیج‌فارس به دلیل شرایط اقلیمی ویژه‌ی حاکم بر آن بسیار شکننده و آسیب‌پذیر است و ورود کمترین آلاینده‌ها به داخل دریا اثرات مخربی بر سلامت آبزیان و موجودات آن دارد. خلیج‌فارس با تمام مشکلات محیطی و اقلیمی که بر آن حاکم است از تنوع ژنی بالایی برخوردار است. از طرفی خلیج‌فارس محل حمل و نقل جهانی محسوب می‌شود 

مطلب دیگر :

بایگانی‌های روانشناسی - مرجع مقالات

و این امر موجب شده در سال‌های گذشته لکه‌های نفتی بسیاری از این نفت‌کش‌ها در آب‌های خلیج‌فارس به جا بماند, از طرفی آلاینده‌های صنایع حاشیه سواحل وارد آب این دریا         می‌شوند و همچنین بخشی از آلاینده‌ها بر اثر حرکت نفت‌کش‌ها و شناورها, رها کردن آب توازن کشتی‌ها- حفاری و عملیات کشف نفت- تراوش و استخراج نفت و ریختن زباله‌ها از داخل شناور‌ها به خلیج‌فارس تزریق می‌شوند. مرجان‌های زیبا و گونه‌های نادر گیاهی و جانوری در حالی قربانی توسعه بی رویه غیر اصولی و هجوم انواع آلاینده‌ها به درون دریا می‌شوند که هنوز سازمان حفاظت از محیط زیست به عنوان دستگاه متولی حفظ محیط زیست نتوانسته اقدام موثر و شایسته‌ای در این زمینه انجام دهد. که در نهایت اینگونه بی‌توجهی‌ها منجر به مرگ و میر آبزیان و مهاجرت آن‌ها به خارج از منطقه, تغییرات در تنوع زیستی و کاهش تنوع زیستی و تغییر رفتار موجودات در محیط زیست منطقه می‌شود که از جمله آثار ناشی از آن آلودگی دریاهاست.

بخش اعظم آلاینده‌های موجود در خلیج‌فارس از نوع نفتی است, از طرفی نفت از میلیون‌ها ترکیب تشکیل شده است که در کل می‌توان آن‌ها را در ۴ دسته تقسیم‌بندی کرد که عبارتند از ترکیبات آروماتیک, هیدروکربن‌های اشباع, رزین‌ها و آسفالتن‌ها. از طرفی ترکیبات آروماتیک با توجه به تعداد حلقه‌های بنزنی به کار رفته در ساختارشان تقسیم‌بندی می‌شوند که در این پروژه از فنل بعنوان یک ترکیب آروماتیک تک حلقه و از نفتالین بعنوان یک ترکیب دو حلقه استفاده شده است. ترکیبات آروماتیک از طریق استنشاق, بلعیدن و تماس مستقیم با پوست قابلیت ورود به بدن داشته و در صورت بروز این رخداد منجر به بروز علایمی چون استفراغ, سرگیجه و اسهال می‌شود و با توجه به خصوصیات شیمیایی که دارا می‌باشند, توانایی ایجاد جهش در ژنوم موجودات زنده را دارند و می‌تواند منجر به بروز سرطان در موجود زنده شوند. در این پروژه با بررسی آلودگی منطقه ساحلی استان بوشهر به ترکیبات آروماتیک موفق به جداسازی و شناسایی ۹ سویه تجزیه کننده ترکیبات آروماتیک شده و با رسم درخت فیلوژنی به بررسی جد مشترک میکروارگانیسم‌ها پرداخته‌ایم. بطور کلی این پایان ‌نامه از ۵ فصل تشکیل شده است که عبارتند از فصل اول شامل کلیه قسمت‌های مربوط به پروپوزال جهت بیان مسئله و ارائه ضروریات اجرایی شدن مسئله و اهداف پروژه. فصل دوم مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق. فصل سوم شامل روش اجرای تحقیق می‌باشد.در فصل چهارم به تجزیه و تحلیل داده‌ها پرداخته ودر نهایت در فصل پایانی به بحث و نتیجه‌گیری و بیان پیشنهادات می‌پردازیم.
۲-۱- بیان مسئله
تجزیه زیستی مواد، به فرایندی اطلاق می‌شود که در طی آن مواد آلوده‌کننده خارجی به وسیله میکروارگانیسم‌هایی که قادرند از آنها استفاده کنند، به مواد بی‌ضرر تبدیل می‌شوند (Luis and Mara et al 2000, 69-75; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496). که در آن از میکروب‌های مختلف استفاده می‌شود و اساس کار آن استفاده از جمعیت‌های میکروبی به منظور تجزیه آلاینده‌ها بوده بنابراین ضرورت نظافت زیستگاه‌های طبیعی جمعیت‌های میکروبی قبل از هر کار دیگر لازم و ضروری می‌باشد (Aitken and Stringfellow et al 1998, 743-752). آلودگی نفتی از معضلات زیست محیطی می‌باشد، هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46) نفت‌خام کمپلکس پیچیده‌ای از مخلوط صد‌ها نوع ترکیب مختلف شامل هیدروکربن‌ها, نیتروژن, گوگرد و وانادیوم است که قسمت هیدروکربن شامل ترکیبات آروماتیک, آلیفاتیک و آسفالتی است (Sisler and Zobell 1987, 521-522; Chaıneau and Rougeux et al 2005, 1490-1496; Feijoo-Siota and Rosa-Dos- Santos 2008, 185-192) ورود هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه‌ای PAHs[1] به محیط زیست, اثرات بسیار خطرناکی در زندگی انسان خواهد داشت. مشخص شده است که PAH ها عوامل بالقوه سرطان‌زا برای انسان می‌باشند و به سرعت وارد بدن شده و در بافت‌های چربی بدن ذخیره می‌شوند (Koch and Fuchs 1992, 649-671). هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط هستند که براساس فعالیت‌های مختلف در محیط تجمع می‌یابند (Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46). این آلاینده‌ها یکی از مهمترین آلودگی‌های زیست محیطی دنیا محسوب می‌شود که در اثر دفع و دور ریز نامناسب فاضلاب‌ها، ضایعات، پساب صنعتی و پخش آلاینده‌ها توسط نیروگاه‌ها و نشت آلاینده‌ها از مخازن نفت و ایستگاه سوختگیری و غیره وارد محیط زیست می‌شوند ((Ewies and Ergas et al 1998, 80-89; Dobler and Saner et al 2000, 41-46; Cappello and Crisari et al. 2012, 39-50). استفاده از فعالیت‌های بیولوژیکی محیطی (باکتری‌های تجزیه کننده) در جهت حذف هیدرو‌کربن‌های نفتی که در این تحقیق ترکیبات آروماتیک می‌باشد نسبت به روش‌های فیزیکی (سوزاندن) که آلودگی زیست محیطی ایجاد می‌کند و روش شیمیایی (سورفکتانت‌ها) که روشی پر‌هزینه و دارای محدودیت می‌باشد مزیتی قابل توجه‌ای دارد (MacGillirray and Shiaris et al 1999, 90-101; Vinas and Grifoll et al 2002, 252-261; Moslemi and Vosoughi et al 2005, 15-23). میزان تجزیه و معدنی شدن ترکیبات آلی وابسته به غلظت ترکیبات است بطوریکه غلظت بالای هیدروکربن‌ها با محدود کردن مواد غذایی و اکسیژن یا از طریق اثرات سمی ایجاد شده بوسیله هیدروکربن‌های فرار از تجزیه زیستی ممانعت می‌کند. رشد میکرواورگانیسم‌ها روی هیدروکربن‌ها اغلب همراه با امولسیونه کردن منابع کربن نامحلول در محیط کشت است. در اغلب موارد این همراه با تولید عوامل امولسیونه کننده خارج سلولی در طی شکست هیدروکربن‌ها می‌باشد این فرایند رشد میکرواورگانیسم روی نفت خام و متابولیزه کردن آن را امکان‌پذیر می‌سازد (حسن شاهیان و همکاران ۱۳۸۷، ۸-۱؛ طلایی و همکاران ۱۳۸۸، ۶۸-۵۷؛ طلایی و همکاران ۱۳۸۹، ۶۸-۸۰). در این تحقیق هدف بر این است که با جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده ترکیبات آروماتیک در اکوسیستم ایران و بکارگیری آنها به روش تجزیه زیستی موجبات کاهش این آلاینده‌ها فراهم گردد.
۳-۱- اهمیت و ضرورت انجام تحقیق
رشد روز افزون فعالیت‌های صنعتی از یک سو و عدم رعایت الزامات زیست‌ محیطی از سوی دیگر که باعث افزایش آلاینده‌ها زیست‌محیطی در چند دهه اخیر شده، ضرورت جلوگیری و ایجاد روش‌های بهینه‌تر و اقتصادی‌تر برای از بین بردن این آلودگی‌های محیطی بیش از پیش قابل توجه است. هیدروکربن‌های نفتی یک دسته از آلاینده‌های خطرناک محیط

دانشکده علوم پایه گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی پایان نامه دوره‌ کارشناسی ارشد در رشته ...

۴-۹-پیشنهادات ۸۱
چکیده:
اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق ۵ و ۱۰ متر جمع‌ آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با بهره گرفتن از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد ۸۰ جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه ۷ جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±۱.۴) و (۱۸±۱.۴) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (۱۴±۱.۴) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن ۱۶S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که ۷ جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با  خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.
فصل اول: مقدمه
۱- مقدمه
۱-۱- تاریخچه آنتی بیوتیک
مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه ^[۱]برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[۲] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال ۱۹۱۰ پائول ارلیخ^[۳] ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[۴] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز^[۵] اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[۶] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[۷] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.
آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن ۱۹ آقای لوئی پاستور^[۸] و رابرت کخ^[۹] باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.
اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک^[۱۰] در سال ۱۹۲۸ میلادی انجام گرفت. در تابستان سال ۱۹۲۸ فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام کارهای معمول آزمایشگاهی که می‌بایست کشت‌های باکتریایی را که در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد کرده بودند زیر میکروسکوپ بررسی کند، متوجه شد که در یکی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد که ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود که وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تکه‌ای کپک به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت که کپک چیزی تولید می‌کند که باعث مرگ باکتری‌های استافیلوکوکوس^[۱۱] در ظرف کشت شده بود. فلمینگ کپک را جدا کرد و آن را به عنوان یکی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم^[۱۲] شناخت، و ماده آنتی بیوتیکی را که تولید می‌کرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد که پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلکه عاملی شد تا برای کشف آنتی بیوتیک‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از ترکیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.

در سال ۱۹۴۵ جایزه نوبل در پزشکی به طور مشترک به او و فلوری[۱۳] و چاین[۱۴] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت 

ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[۱۵] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال ۱۹۴۰برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین^[۱۶] در سال ۱۹۳۹ به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[۱۷]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین^[۱۸] در سال ۱۹۴۳ از باکتری استرپتومایسس^[۱۹]، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004).  استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها  که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن^[۲۰]،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).

1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها

بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده 

مطلب دیگر :

مهارت های اجتماعی

قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال^[۱] که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک^[۲] که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره ۱-۱ مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند.

۱-۱-۱-۱- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باکتری‌ها یک لایه خارجی سخت دارند که دیواره سلولی آنها است و شکل میکروارگانیسم را تعیین می‌کند و از سلول باکتری که فشار اسموتیک بالایی دارد محافظت می کند . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.
۲-۱-۱-۱- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء۳۰S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء ۵۰Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).
۳-۱-۱-۱- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA  می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.
۴-۱-۱-۱- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یک غشای سیتوپلاسمی محصور شده که به‌عنوان یک غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌کند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مکانیسم اثر پلی‌میکسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باکتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی که با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، کلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول، ایمیدازول، تری آزول‌ها و یونوفورها اشاره کرد.
۲-۱-۱- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک
ژن تولیدکننده آنتی‌بیوتیک و دیگر متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌ها معمولا به‌صورت کلاستر^[۱] و یا به صورت پلاسمیدهای خطی بزرگ دیده می‌شوند. از نظر ژنتیکی آنتی بیوتیک‌ها با وزن مولکولی پائین، ساختار بسیار پیچیده دارند که نزدیک به ۵۰ ژن در سنتز آنها دخالت دارد (Cundliffe, 2006). این در حالی است که یک ژن به آسانی می‌تواند یک پروتئین به وزن ۱۰۰ کیلو دالتون را رمز گذاری کند(Challis, 2003). بعضی از جنس‌های استرپتومیسس بیش از ۲۰ کلاستر ژنی را به سنتز متابولیت‌های ثانویه اختصاص داده‌اند. هر آنتی بیوتیک حدود ۱% از کل ژنوم اکتینومیست تولید کننده را لازم دارد. علاوه بر ژن‌های لازم برای سنتز آنتی بیوتیک بعضی کلاستر‌ها دارای ژن‌های تنظیم کننده تولید آنتی بیوتیک می‌باشند (Cundliffe, 1989).
[1] . Clustered
[1] . Cidal
[2] . Static
[1] . Santonin
[2] . Cinchona
[۳] . Paul Ehrlich
[4] . Arsphenamine
[5] . Antibiosis
[6] . Vilmain
[7] . Antagonism
[8] . Louis Pasteur
[9] . Robert Koch
[10] . Allexander Fllemiing
[11] . Staphylococcus
[12] . Penicillium
[13] . Florey

واحد علوم دارویی دانشکده علوم و فناوری های نوین، گروه زیست شناسی پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ...

۳-۶) سنجش اریترومایسین تولید شده.۱۰۶
۳-۶-۱) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 .
3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9
3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4
3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو۱۰۸
۳-۶-۵) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین.۱۰۹
۳-۶-۶) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با بهره گرفتن از کلروفرم.۱۱۱
۳-۶-۷) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو.۱۱۲
۳-۶-۸) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو۱۱۳
۳-۷) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین۱۱۳
۳-۷-۱) محیط کشت مولر هینتون آگار.۱۱۳
۳-۷-۲) محیط کشت مولر هینتون براث.۱۱۴
۳-۷-۳) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر۱۱۴
۳-۷-۴) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین۱۱۴
۳-۷-۵) تهیه مایع تلقیح۱۱۵
۳-۷-۶) تهیه چاهک۱۱۶
۳-۷-۷) تهیه بافر فسفات با pH 8.
3-7-8) تهیه محلول های استاندارد۱۱۶
۳-۷-۹) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها۱۱۷
۳-۷-۱۰) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد۱۱۷
۳-۷-۱۱) رسم منحنی استاندارد۱۱۷
۳-۸) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا۱۱۸
۳-۸-۱) فاز متحرک۱۱۸
۳-۸-۲) آماده سازی مایع تخمیر.۱۱۸
۳-۸-۳) اندازه گیری مقداراریترومایسین۱۱۹
۳-۹) کروماتوگرافی لایه نازک TLC .
فصل چهارم: نتایج پژوهش
۴-۱) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین (محیط شاهد).۱۲۳
۴-۱-۱) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل).۱۲۳
۴-۱-۲) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل).۱۲۴
۴-۱-۳) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)۱۲۵
۴-۱-۴) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل).۱۲۵
۴-۲) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین.۱۲۸
۴-۲-۱) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت۱۲۹
۴-۲-۲) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی۱۳۰
۴-۲-۳) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی۱۳۰
۴-۳) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین۱۳۱
۴-۴) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه ۱۵ گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه ۱۵ گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر.۳۲
۴-۴-۱) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین۱۳۲
۴-۴-۲) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر.۱۳۳
۴-۴-۳) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی۱۳۳
۴-۴-۴) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea.
فصل پنجم: بحث و پیشنهادات
۵-۱) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک.۱۳۷
۵-۱-۱) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین.۱۳۷
۵-۱-۱-۱) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین.۱۳۸
۵-۲) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین۱۴۴
۵-۳) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرایند.۱۴۵
۵-۳-۱) سینتیک رشد میکروبی۱۴۶
۵-۴) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر.۱۴۸
۵-۵) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین۱۴۹
۵-۶) برآورد هزینه ها۱۵۳
۵-۶-۱) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی۱۵۳
۵-۶-۱-۱) استفاده از ۳۰ گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر۱۵۴
۵-۶-۱-۲) استفاده از ترکیب ۱۵ گرم در لیتر کنجاله سویا و ۱۵ گرم در لیتر کنجاله کلزا۱۵۴
۵-۷) پیشنهادات.۱۵۶
منابع و مراجع۱۵۸
خلاصه انگلیسی۱۶۵
ضمائم .۱۶۶
چکیده:
امروزه یکی از مهم ترین و پرمصرفترین آنتی بیوتیک های مورد استفاده اریترومایسین می باشد که در درمان طیف وسیعی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرد. برای تولید این آنتی بیوتیک پنج مرحله کلیدی وجود دارد که از بین این مراحل، مهم ترین و پر هزینه ترین مرحله که در آن اریترومایسین تولید می شود مرحله تخمیر است. ترکیبات محیط کشت مرحله تخمیر  نقش مهمی را در میزان تولید محصولات ثانویه و  پارامترهای تخمیر ایفا می کنند همچنین سوبسترای نیتروژنی یکی از اجزای اصلی محیط کشت در این مرحله و یکی از موارد اصلی هزینه در مخلوط محیط کشت می باشد. بنابراین استفاده از منابع نیتروژنی با قیمت مناسب و بازده قابل قبول از اهمیت ویژه ای برخوردار است . در این پژوهش اثرغلظتهای مختلف ترکیبی از دو منبع نیتروژنی کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید آنتی بیوتیک اریترومایسین بررسی شده است. برای تولید اریترومایسین از باکتری رشته ای Saccharopolyspora erythraea   استفاده شده است. سوسپانسیون اسپوری به محیط بذردهی تلقیح شده و در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد به مدت ۴۰ تا ۴۴ ساعت با دور rpm 200 در شرایط هوازی گرما گذاری شد و بهترین نمونه بذردهی به ارلن های حاوی محیط تخمیر اضافه شد و با pH اولیه ۸/۶ در شیکر انکوباتوردار با دمای ۳۳ درجه سانتیگراد و دور rpm220 به مدت ۱۱ روز گرما گذاری شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری شد . میزان اریترومایسین تولید شده به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد . غلظت های منابع نیتروژنی مورد استفاده عبارت بود از :
۱- کنجاله سویا ۱۵ گرم در لیتر و کنجاله کلزا ۱۵ گرم در لیتر ( هر کدام ۵۰ % محیط )
۲- کنجاله سویا ۱۸ گرم در لیتر ( ۶۰ % ) و کلزا ۱۲ گرم در لیتر ( ۴۰ % )
۳- کنجاله سویا ۱۲ گرم در لیتر ( ۴۰ % ) و کلزا ۱۸ گرم در لیتر ( ۶۰ % )

۴-کنجاله سویا ۲۱ گرم در لیتر ( ۷۰ % ) و کلزا ۹ گرم در لیتر ( ۳۰ % )

۵- کنجاله سویا ۹ گرم در لیتر ( ۳۰ % ) و کلزا ۲۱ گرم در لیتر ( ۷۰ % )
بر طبق نتایج بدست آمده، استفاده از مخلوط ۱۵ گرم در لیتر کنجاله سویا و ۱۵ گرم در لیتر کنجاله کلزا ،دارای بالاترین میزان تولید اریترومایسین بوده و نسبت به استفاده از ۳۰ گرم در لیتر کنجاله سویا که حالت مورد استفاده در صنعت می باشد ۰۱۱/۱ برابر اریترومایسین بیشتری تولید نموده است.
مقدمه:
بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با بهره گرفتن از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( ۴۸ ).
بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال ۱۸۸۰ برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(۵۲).
در دهه ۱۹۴۰ و ۱۹۵۰ که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.

طی سالهای ۱۹۲۵ تا ۱۹۶۵ استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و به ویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(۱۲).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرایند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :

مطلب دیگر :

مقاله رایگان درباره امنیت بین المللی

۱- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرایند می باشد.
۲- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرایند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( ۱۷)
فصل اول: کلیات
۱-۱- طرح موضوع
در این پژوهش سعی بر این شده تا با بهره گرفتن از یک منبع نیتروژنی بومی ( ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا ) بتوانیم تولید صنعتی آنتی بیوتیک اریترومایسین را به روش فرمانتاسیون میکروبی بهینه سازی کنیم . امروزه در صنعت تولید این آنتی بیوتیک از کنجاله سویا استفاده می شود. اما در این پژوهش مشخص شد که استفاده از ترکیب این دو منبع نیتروژنی علاوه بر بالا بردن بازده محصول ، تولید اریترومایسین را از نظر اقتصادی مقرون به صرفه تر می کند. منبع نیتروژنی پیشنهاد شده با نسبت های مختلف به محیط کشت تخمیر باکتری Saccharopolyspora erythraea  اضافه شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری و میزان اریترومایسین تولیدی به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد.
۲-۱- بیان مسئله
امروزه بیماریهای عفونی ناشی از میکروارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب میشود و هزینه های زیادی برای درمان آنها اختصاص داده می شود. به همین علت نیاز به یافتن آنتی بیوتیکهای جدید و افزایش کارایی آنتی بیوتیکهای شناخته شده، بالا بردن بازده تولید و اقتصادی تر کردن فرایندهای تولید بسیار مهم می باشد. آنتی بیوتیکها مهمترین فراورده دنیای میکروبها هستند و جز پرمصرفترین داروها می باشند. کشف پنی سیلین توسط فلمینگ در سال ۱۹۲۹ را میتوان آغاز عصر آنتی بیوتیکها دانست. در تعریف کلی آنتی بیوتیک به ماده شیمیایی گفته میشود که توسط میکروارگانیسم تولید شده و میتواند بصورت انتخابی رشد سایر میکرو ارگانیسمها و یا تومورهای بدخیم را متوقف کند. امروزه این داروها در دامپزشکی هم کاربرد دارد و به عنوان ماده افزودنی در غذای حیوانات به کار می رود و همچنین به عنوان مواد حافظ گیاهان و غذاها نیز به کار میروند. بر اساس پیش بینی های انجام شده میزان مصرف این دارو در سال ۲۰۱۳ بیش از ۴۰ میلیارد دلار میباشد و این میزان رو به افزایش خواهد بود. پس میتوان گفت که آنتی بیوتیکها اهمیت اقتصادی زیادی دارند. یکی از آنتی بیوتیکهای مهم و پرمصرف مورد استفاده اریترومایسین است که در درمان طیف وسیعی از بیماریها کاربرد دارد. این دارو جز ماکرولیدهاست و فرمول شیمیایی آنH H ₆₇ NO₁₃ و وزن ملکولی آن ۹۴/۷۳۳ گرم بر مول است.این آنتی بیوتیک با اتصال به زیر واحد ۵۰ S ریبوزوم باکتریایی ممانعت کننده سنتز پروتئین هستند. لازم به ذکر است که پروتئینهای L₁₅ و L₁₆ در اتصال اریترومایسین به زیر واحد ریبوزوم نقش دارند. در پیکره اریترومایسین یک حلقه لاکتونی بزرگ وجود دارد که ۱۳ کربنی است. همچنین یک قند آمین دار به نام دزز آمین دارد که با پیوند گلیکوزیدی به هسته لاکتونی متصل است. اریترومایسین یک ترکیب کریستالی بی رنگ است که در آب کم محلول است ولی در بسیاری از حلالهای آلی مانند استن به خوبی قابل حل است. اریترومایسین یک باز ضعیف است و طعم تلخی دارد. این دارو باکتریو استاتیک است ولی در غلظتهای بالا باکتریوساید میشود. این دارو برای درمان برنشیت، زخمهای عفونی،دیفتری، گلودرد،تب مخملک و . موثر است. بازار مصرف این دارو اکنون دارای رشد ۶ تا ۸ درصد افزایش تولید در سال میباشد. آمار مصرف آن در ایران در سال ۸۹ ، ۲/۱۱ میلیارد تومان گزارش شده است.
اریترومایسین علیه ارگانیسمهای گرم مثبت نظیر استرپتوکوک، استافیلوکوک، پنوموکوک و ارگانیسمهای گرم منفی مثل نایسریا و بردتلا پرتوسیس موثر است.این دارو جایگزین مناسبی برای پنی سیلین در افراد آلرژیک نسبت به پنی سیلین است.  با توجه به این نکته تلاش برای بهینه سازی و کاهش قیمت روند تولید این دارو با اهمیت است و در این پژوهش سعی بر این شده که راه حلی برای کاهش قیمت و بومی سازی تولید این دارو پیدا شود. به طور کلی فرایند تولید آنتی بیوتیکها شامل ۵ مرحله اصلی است .آنچه در این پژوهش بیشتر مدنظر است ، تغییر در ترکیبات محیط کشت به کار رفته در مرحله تخمیر است. عمل تخمیر در فرمانتور یا بیوراکتور انجام میشود. یک فرایند تخمیری به روش های غیر مداوم، مداوم و نیمه بسته انجام میشود.عواملی در طی یک فرایند تخمیر بیشترین اهمیت را دارند و محققان با تغییر در شرایط آنها سعی در بالا بردن بازده و کاهش هزینه های تولید دارند. این عوامل عبارتند از : ترکیبات محیط کشت، درجه حرارت، هوادهی، pH ، همزنی، دی اکسید کربن، کف، استرلیزه بودن محیط و ظروف.
در تهیه محیط کشت، تاکید زیادی روی کنترل کردن بهای مواد خام میشود. زیرا این مواد میتوانند تاثیر مهمی روی محصول نهایی بگذارند. از جمله معیارهای دیگر برای انتخاب مواد خام :
– حداکثر بازدهی محصول به ازای هر گرم سوبسترا فراهم کند.
– حداکثر غلظت محصول را فراهم کند و اجازه حداکثر سرعت تولید را بدهد.
– ارزان باشد و در طول سال با کیفیت یکسان و به راحتی در دسترس باشد.
– حداقل مشکلات را در جنبه های دیگر فرایند مخصوصا هوادهی و هم زدن و خالص سازی و استخراج و فراهم کند.